您現在的位置：首頁 > 技術文章 > TA克隆（TA-cloning）
            
     
            
       
            
      
            TA克隆（TA-cloning）
            
       
          1. 發布日期：2013-11-09      瀏覽次數：5218 
            2. 
      
              
     
                   TA克隆（TA-cloning）是利用Taq聚合酶的特性將PCR產物克隆的方法，又稱為T-載體克隆。
                   Taq DNA聚合酶在四種dNTP存在下可以向非特性的PCR產物的3’末端特異性的添加一個A。這也成為Taq酶催化的PCR產物不能的連接至平末端載體的主要原因。相反地，如果此時有一個線性的帶有粘性T末端的載體DNA（T載體），那么帶有A粘性末端的PCR產物就可以的插入載體DNA中。這種方法被稱為TA克隆。
               
              實驗材料：
              Invitrogen公司提供的TOPO 快速TA 克隆試劑盒。我們采用pCR®II-TOPO®體系。
              內含TOPO TACloning® reagents （Box 1） 和 One Shot® Chemically Competent cells （Box 2）.
              TOPO 反應鹽溶液：200 mM NaCl,10 mM MgCl2。
               
              實驗步驟：
               
              總體步驟：
              PCR 反應
              進行TOPO反應，連接PCR產物與TOPO載體
              用連接好的TOPO克隆轉化TOPO感受態細胞
              藍白斑篩選
               
              細節：
              1、PCR 反應
              按正常步驟用Taq聚合酶進行PCR反應循環。
               
              2、進行TOPO反應，連接PCR產物與TOPO載體
              在反應體系中加入如下反應物：
              新鮮的PCR產物1ul
              TOPO反應鹽溶液 1ul
              無菌水 4ul
              TOPO® vector 1ul
              共 6ul
              輕輕混合以上反應物，在室溫（22oC-23oC）溫育5分鐘。
              將以上反應物置于冰上，進行轉化
               
              3、用連接好的TOPO克隆轉化TOPO感受態細胞
              向試劑盒提供的 One Shot® Chemically Competent E. coli中加入2ul以上反應液，輕輕混勻。在冰上進行轉染10分鐘。
              在42oC下熱刺激細胞30秒，然后馬上轉移至冰上。
              向體系中加入250ul 室溫下的SOC 培養液。
              水平離心轉化管（200rpm, 37oC）1小時。
              用10~50ul 轉化液向預熱的培養基鋪板。
               
              4、藍白斑篩選
              取出10個白色或淺藍色的菌落在含有50ug/ml卡那霉素或氨芐青霉素LB培養基中培養。
              提純質粒，進行鑒定。
               
               
              其中的T載體可以用以下三種方法構建：
              Ø 一種載體可以用限制性內切酶如XcmI, HphI, 與MobII 酶切消解產生，3‘末端未配對的T。
              Ø 應用末端轉移酶與雙脫氧TTP加入一個突出的T殘基到線形化載體的3’末端。
              Ø 應用不依賴末端的Taq DNA聚合酶的末端轉移酶活性在線形化載體的3‘末端出的羥基基團上催化連接上一個T堿基。
               
                  但是并非所有可用于PCR的耐熱DNA聚合酶都具有非模版依賴的A添加能力。例如常用于高精度PCR反應的Pfu 聚合酶只能產生平末端，因而不能夠用于TA克隆。
               
                   目前，T載體可以從許多供應商那里購買得到克隆化的試劑盒，如pCR-Script[SK+]（from Statagene 公司），PCRII的TA克隆試劑盒（from Invitrogen 公司），PGEM-T （from Promega 公司）等等。
               
                  以下以PCRII的TA克隆試劑盒（from Invitrogen 公司）為例講述TA cloning 的過程：
                  從牛痘病毒（Vaccinia）中提取的DNA拓撲異構酶1可以識別5’-CCCTT序列，并連接5’-CCCTT和外源DNA（Shuman, 1991，1994），因而可用于TA cloning。
               
              參考文獻：
              1. Joseph Sambrook，David W Russell. Molecular cloning（3rd edition）
              2. Shuman, S. （1991）.  Recombination Mediated by Vaccinia Virus DNA Topoisomerase I in Escherichia coli is Sequence Specific. Proc. Natl. Acad. Sci. 
              3. Holton TA, Graham MW.  A simple and efficient method for direct cloning of PCR products using ddT-tailed vectors.  Nucleic Acids Res. 1991 Mar 11;19（5）:1156
              4. Marchuk D, Drumm M, Saulino A, Collins FS.  Construction of T-vectors, a rapid and general system for direct cloning of unmodified PCR products. Nucleic Acids Res. 1991 Mar 11;19（5）:1154.
              5. Borovkov AY, Rivkin MI.  XcmI-containing vector for direct cloning of PCR products. Biotechniques. 1997 May;22（5）:812-4. 
              6. Kovalic D, Kwak JH, Weisblum B.  General method for direct cloning of DNA fragments generated by the polymerase chain reaction.  Nucleic Acids Res. 1991 Aug 25;19（16）:4560. 
              7. Hengen PN.  Fidelity of DNA polymerases for PCR. Trends Biochem Sci. 1995 Aug;20（8）:324-5. 
              8. Leal, J.F.M.; López-Barea, J.; Dorado, G.  T-vector cloning and high performance PCR with SuperTth from Thermus thermophilus  Genetic Analysis: Biomolecular Engineering Volume: 12, Issue: 2, October, 1995, pp. 119-121  
              9. Hoover C, 1998 July 8. Invitrogen web catalog.  Accessed 1999 Feb 14.